- MCP、血管内皮抑素抑制结肠癌肝转移的作用研究
- 宣布时间： 2019/2/22 点击次数：3005
MCP、血管内皮抑素抑制结肠癌肝转移的作用研究
刘海鹰, 黄志良, 杨国华
(广州医学院隶属肿瘤医院腹部外科, 广东 广州 510095)
实用肿瘤杂志2008年 第23卷 第6期
摘要: 目的 修饰柑橘果胶(modified citrus pectin,MCP) 和血管内皮抑素(endo statin, ES) 已划分被证实能通过差别机制抑制肿瘤转移的形成。探讨差别浓度的M CP 及与ES 联用后对小鼠结肠癌肝转移的抑制作用。要领经小鼠脾脏下极包膜注入CT 226 结肠癌细胞建立结肠癌肝转移模型。135 只B albƒc 小鼠随机分为阴性比照组、阳性比照组、低剂量M CP 组、中剂量M CP 组、高剂量M CP 组、ES 组、低浓度M CP+ ES 组、中浓度M CP+ ES 组和高浓度M CP+ ES 组。M CP 加入饮用水中, 各组浓度划分为0、0、0101、01025、0105、0、0101、01025 及0105 gƒL , ES 剂量均为2 m gƒkg, 腹腔内给药, 隔天1 次。3 周后视察各组小鼠肝转移情况。制作肝转移瘤组织芯片, 用免疫组化要领检测肝转移瘤组织中galectin23、V EGF 的表达和肿瘤微血管密度(M VD ) , 接纳酶联免疫吸附实验(EL ISA ) 要领检测小鼠血清galectin23 和V EGF 浓度。结果 (1) 除阴性比照组外, 各组肝转移率划分为100. 0%、8010%、7313%、6010%、8617%、7313%、7313% 和6010%。高浓度M CP 组、中浓度M CP+ ES 组、高浓度M CP+ ES 组与阳性比照组比较, 肝转移灶数目均明显减少(P < 0105); 高浓度M CP+ ES 组与ES 组比较, 肝转移灶数目明显减少(P < 0105)。
(2) 除阴性比照组外, 各组脾脏种植瘤体积中位数划分为 1151 cm 3、0193 cm 3、0177 cm 3、0170 cm 3、1125 cm 3、1115 cm 3、0175 cm 3 和0167 cm 3。中浓度M CP 组、高浓度M CP 组、中浓度M CP+ ES 组、高浓度M CP+ ES 组与阳性比照组比较, 脾脏种植瘤体积均明显缩小(P < 0105)。 (3) 各组肝转移瘤galectin23、V EGF 表达相互间比较无明显差别(P 值均> 0105)。 (4) 阳性比照组和各治疗组的血清galectin23、V EGF 浓度均明显高于阴性比照组(P 值< 0101);
阳性比照组与各治疗组相互间比较无明显差别(P 值均> 0105)。 (5) 各组肝转移瘤M VD 划分为 28147±3122、27147±3122、26192±1147 26191±2141、26143±1147、26150±3109、25145±1196 和24173±3109, 各浓度M CP+ES 组肝转移瘤M VD 计数与阳性比照组比较均有明显减少(P 值均< 0105)。
结论 单用M CP 或与ES 联用均能有效抑制结肠癌肝转移和微血管生成。
要害词: 结肠肿瘤; 肝肿瘤ƒ继发性; 肝肿瘤ƒ药物疗法; 果胶类; 内皮抑素类ƒ治疗应用; 基因疗法
据统计, 约50% 结直肠癌患者泛起肝转移, 肝转移是影响结肠癌治疗效果和术后生存率的主要原因, 抑制肝转移有助显著提高结肠癌的疗效和生存率[ 1 ]。但目前通过针对肿瘤转移差别环节以抑制肝转移形成的研究未几。研究已证实M CP 的半乳糖身分能有效阻断galectin 23 的功效表达以抑制肿瘤转移形成, 血管内皮抑素(ES) 则能通过抑制新生血管形成限制肿瘤转移的形成。目前未有报道联合使用两者对肿瘤转移的影响。本研究主要利用结肠癌肝转移动物模型, 探讨M CP 联用ES 对结肠癌肝转移的抑制作用。
1 质料与要领
111 质料和仪器
11111 细胞株 小鼠结肠腺癌细胞株CT 226 由本院生物工程实验室传代生存。细胞使用R PM I21640细胞培养液(含 10% 新生小牛血清、青霉素 100 U ƒ m l、链霉素100 m gƒL ) , 37℃、5% CO 2 培养箱中进行传代培养。
11112 实验动物 6～ 8 周龄Balbƒc 雌性小鼠135只(由广东省医学动物实验中心提供, 动物及格证号: SCXK 粤2006A 019) , 体重20～ 25 g, 实验小鼠无特殊病原菌; 实验在中心SPF 级动物实验室进行。
11113 药物 M CP 由美国圣特莱公司提供。ES 由烟台麦得津生物公司提供。羊抗鼠ga lectin 23、V EGF和CD 34 免疫组化试剂盒均购自深圳晶美生物制品公司。
11114 主要仪器 美国Beecher 组织芯片仪, 多功效倒置相差显微摄影系统、上�？苹猄T 360 全自动多功效酶标仪。
112 要领
11211 结肠癌肝转移动物模型的建立 取处于指数生恒久的CT 226 细胞加入适量生理盐水配成2× 106 ƒm l 细胞悬液。4% 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠 ( 011 m gƒ10 g) , 取左肋缘下平行肋缘切口, 翻开腹腔, 在脾脏下极包膜注入CT 226 细胞悬液0105 m l, 1 号丝线间断缝合切口关腹。135 只小鼠随机分为 9组, 每组15 只: (1) 阴性比照组; (2) 阳性比照组; (3) 低浓度M CP 组(1% ) ; (4) 中浓度M CP 组(215% ) ; ( 5) 高浓度M CP 组( 5% ) ; ( 6) ES 组; ( 7) 低浓度M CP + ES 组; (8) 中浓度M CP+ ES 组; (9) 高浓度M CP+ ES 组。全部小鼠术后第2 天开始药物实验, M CP 加入饮用水中配成相应浓度, ES 隔天腹腔内注射 1 次, 比照组以同等量生理盐水取代饮用水和注射液。实验期间小鼠自由进食。
1. 2. 2 病理视察 实验3 周后摘眼球法收罗小鼠
外周血提取血清, 引颈法正法小鼠。翻开腹腔视察脾脏有无病灶, 纪录肿瘤巨细和数目。肿瘤体积V = ab2 ƒ2 (a: 肿瘤****径; b: 肿瘤最小径) , 如有多个肿瘤则盘算体积总和。仔细视察肝脏有无转移灶, 纪录转移灶数目, 所有转移瘤均经病理切片H E 染色证实。凭据周志伟等[ 2 ] 要领将肝转移灶数目分为四个品级进行统计: 0 级: 肝脏无转移病灶; I 级: 1～ 5 个转移病灶; " 级: 6～ 10 个转移病灶; ? 级: > 10 个转移病灶。
1. 2. 3 肝转移瘤组织芯片制作 复查H E 及免疫
组化染色切片, 选择典范癌灶(富有癌细胞且无坏死出血的区域)。用组织芯片仪在预先准备好的空洋蜡块(25 mm ×25 mm ×20 mm ) 上按设计位置打孔, 孔径112 mm , 孔间距110 mm , 排成10 行×5 列共50 点微阵列。用112 mm 穿刺针将标记好的瘤体组织柱取出, 转移到空洋蜡块的相应位置, 将 47 例组织芯安排于两个空洋蜡块中, 其中每个组织芯蜡块含47 个组织芯(包括两个标记点)。将制成的组织芯蜡块面朝下置于铜板上55℃安排30 分钟, 轻压�？槭棺橹谀？樯吓牌�, 冷却至室温, 蜡块在4℃×4 h 预冷后快速进行切片修整, 切片待用。
11214 免疫组化要领 对肝转移瘤组织芯片划分
进行galectin 23、V EGF 免疫组化染色, CD 34 免疫组化染色接纳石蜡切片。所有操作严格凭据免疫组化试剂盒说明进行(EnV isio n 法) , 结果判断由两名病理科医师双盲阅 片。 galectin 23 表达强度参考San juan 等[ 3 ] 的标准, V EGF 表达强度参考To i 等[ 4 ] 的标准, 均分为阴性(- )、弱阳性(+ )、阳性(+ + ) 和强阳性(+ + + )。M VD 计数参考W eidner 等[ 5 ] 的要领, 先在低倍镜下(×40) 确定肿瘤内新生血管最密集区作为“热点”进行血管计数, 然后在高倍镜下(×200) 计数5 个视野, 将5 个视野的血管平均数作为该切片的微血管密度值(M VD 值)。
11215 EL ISA 实验要领(双抗体夹心法) 小鼠外周血离心(3 000 rƒm in×5 m in) 提取血清, 严格凭据 EL ISA 试剂盒说明书进行操作: 血清以1∶20 稀释后每孔加入100 Λl, 室温孵育2 小时, 洗板, 加入事情浓度辣根过氧化物酶标抗体 100 Λl, 室温孵育 2 小时, 洗板, 再加入100 Λl 底物四甲联苯胺, 室温避光孵育20 分钟, 加入50 Λl 终止液, 酶标仪450 nm 波优点读取吸光度(OD ) 数值。凭据标准品OD 值拟合标准曲线回归方程和绘制标准曲线, 凭据回归方程换算各样本galectin 23、V EGF 浓度。
113 统计学剖析
所有数据接纳SPSS 1010 软件进行统计学处理。 脾脏肿瘤体积、肝转移瘤数目、肝转移瘤组织galectin 23、V EGF 表达, 血清galectin 23、V EGF 浓度比较和M VD 计数比较均接纳非参数检验要领。以P< 0105 具有统计学意义。
2 结 果
211 小鼠存活情况
实验3 周内无小鼠死亡。于第2 周后部分荷瘤小鼠外观可见腹部明显隆起肿块, 泛起运动减少、反应缓慢、毛色昏暗、进食减少和精神萎靡等衰竭现象
(见图1)。
212 肝脏转移瘤数目
实验乐成建立肝转移模型。除阴性比照组外, 各组 肝转移率划分为 100. 0%、8010%、7313%、6010%、8617%、7313%、7313% 和 6010%。中浓度
M CP 组、高浓度M CP 组、中浓度M CP+ ES 组、高浓度M CP + ES 组与阳性比照组比较, 肝转移灶数目均有明显减少(P < 0105)。
213 脾脏肿瘤体积
除阴性比照组外, 各组脾脏种植瘤体积中位数划分为 1151 cm 3、0193 cm 3、0177 cm 3、0170 cm 3、1125 cm 3、1115 cm 3、0175 cm 3 和 0167 cm 3。中浓度M CP 组、高浓度M CP 组、中浓度M CP+ ES 组、高浓度M CP + ES 组与阳性比照组比较, 脾脏种植瘤体积均有明显缩小(P < 0105)。各组脾脏肿瘤体积比较见表1
A : 荷瘤小鼠与正常小鼠 B: 脾脏原位肿瘤与肝转移瘤 C: 肝转移瘤病理图像（HE*200） D: 肝转移瘤病理图像(HE*400)
图1 小鼠结肠癌肝转移模型
注 (1) 3 与阳性比照组比较, P < 0. 05; (2) 中浓度M CP 组与高浓度M CP 组比较、中浓度M CP+ ES 组与高浓度M CP+ ES 组比较、中浓度M CP 组与中浓度M CP+ ES 组比较、高浓度M CP 组与高浓度
M CP+ ES 组比较, 差别均无统计学意义(P > 0. 05)
214 肝转移瘤组织中 ga lectin-3 表达
显微镜下视察切片, 肿瘤细胞胞浆内染成棕黄
色颗粒认定为表达阳性细胞 (见图2)。经统计剖析,
各组肝转移瘤组织 ga lect in23 表达无明显差别 (P > 0105)。 各组肝转移瘤 ga lect in23 表达比较见表 2。
注 各组间比较, 结果差别均无统计学意义(P > 0. 05)
215 肝转移瘤组织中 VEGF 表达和M VD 计数
显微镜下视察切片, 肿瘤细胞胞浆内染成棕黄色颗粒认定为表达阳性细胞 (见图4)。经统计剖析,
各组肝转移瘤组织 V EGF 表达无明显差别 (P >0105) , 见表3。在200 倍光镜视野下计数被CD 34 抗体 染成棕色的微血管数目 (见图3)。经剖析, ES组、各浓度M CP + ES 组肝转移瘤M VD 计数与阳性比照组比较均有明显减少 (P < 0105)。但各M CP 治疗组与阳性比照组比较则无明显差别。 各治疗组相互间比较无明显差别见表4。
注 (1) 3 与阳性比照组比较, P < 0. 05; (2) 与阳性比照组比较,M CP 治疗组的M VD 计数差别无统计学意义 (P > 0. 05); (3) 与 ES组比较 各M CP 治疗组和M CP+ ES 治疗组的M VD 计数均无明显,
减少(P > 0. 05)
216 血清 ga lectin-3 浓度比较
根 据 标 准 曲 线 回 归 方 程 换 算 各 样 本 血 清ga lect in23 浓 度, 各 组 血 清 ga lect in23 浓 度 分 别 为( 14163 ± 10108 ) LgöL、( 91101 ± 22194 ) LgöL、( 82175 ± 20133 ) LgöL、( 79101 ± 17164 ) LgöL、
(85194±15152) LgöL、(88195±2176) LgöL、(86150± 19180) LgöL、(84170±15157) LgöL 和 (93198 ±
16191) LgöL。经检验, 阳性比照组和各M CP 治疗组血 清 ga lect in23 浓 度 明 显 高 于 阴 性 对 照 组 ( P < 0101) ; 阳 性 对 照 组 和 各 M CP 治 疗 组 之 间 血 清ga lect in23 浓度均无明显差别 (P > 0105)。
217 血清 VEGF 浓度比较
凭据标准曲线回归方程换算各样本血清VEGF浓度, 各组血清V EGF 浓度划分为 (19150±4142)ngöL、( 411121 ±11198) ngöL、( 30172 ± 9175) ngöL、( 34180 ± 14189 ) ngöL、( 31193 ± 4176 ) ngöL、
(27197±6153) ngöL、(29157±6194) ngöL、(29177±7126) ngöL 和 (33117±10190) ngöL。 经检验, 阳性比照组和各M CP 治疗组血清V EGF 浓度明显高于阴性比照组 (P < 0101) ; 阳性比照组和各M CP 治疗 组 之 间 血 清 V EGF 浓 度 均 无 明 显 差 异 ( P >0105)。
3 讨 论
结肠癌肝转移形成是一个多办法、多因素的历程。 游离肿瘤细胞的聚集和黏附是转移形成的要害环节, 其中黏附分子在肿瘤转移中起要害的作用[6];新生血管形成和营养供应是转移灶继爆发长的重要原因, 也能为原位肿瘤细胞入血转移提供条件。目前发明在多种高转移 性肿瘤细胞 中 能 高 水 平 表 达ga lect in23[7], 肿瘤细胞外貌的 ga lect in23 分子能直接介导肿瘤细胞间的识别聚集以及细胞与基底质的黏附锚定作用, 并有一定诱导新生血管形成、调理细胞生长的作用。修饰柑橘果胶M CP 是一种从柑橘类水果细胞壁中提取并经特定处理的多糖纤维, 其半乳糖身分能竞争性抑制体内 ga lect in23 配体与其受体结合, 从而关闭阻断 ga lect in23 的功效表达; 另外M CP 也可通过完全关闭 ga lect in23 位点以阻止肿瘤细胞从血管获取营养 对肿瘤生长有一定的抑制作,用[8, 9]。但目前尚未发明M CP 对肿瘤细胞有直接杀氨慎用。 体外实验已证实,M CP 具有抑制肿瘤细胞同型聚集作用和抑制肿瘤细胞与内皮细胞、组织基质黏附的作用[10]; 动物实验也证明, 口服M CP 可抑制 鼠 前 列 腺 癌 和 人 乳 腺 癌、黑 色 素 瘤 的 自 发 转移[11～ 13]。 重组人血管内皮抑素是胶原— (co llagen— ) C 端 20kd 的连接卵白, 能通过抑制血管内皮细胞的迁移和破裂以抑制新生血管形成 阻断肿瘤细胞营养供应, 从而抵达抑制肿瘤增殖和转移的作用。体外细胞实验 ES 能抑制人微血管内皮细胞的迁移和微血管形成[14] 而对肿瘤细胞无直接杀氨慎用。
动物实验和临床试验均证实 ES 对多种肿瘤的进展有明显抑制作用[14, 15]。 而目前尚未有关于M CP 与ES 联用对结肠癌肝转移影响的研究报道, 故本实验首次就M CP 与 ES 对结肠癌肝转移的影响作开端研究。
实验结果显示, 中、高浓度M CP 组, 中、高浓度M CP + ES 组的肝转移数明显少于阳性比照组, 标明单独使用一定浓度的M CP 或M CP 与 ES 联用能有效抑制结肠癌肝转移的形成, 从而也提示通过阻断肿瘤细胞的黏附聚集和新生血管的形成也可抑制肿瘤的转移。 而中、高浓度M CP 组和中、高浓度M CP + ES 组的脾脏肿瘤体积与阳性比照组比较有明显降低, 显示单独使用一定浓度的M CP 或M CP与ES 联用均可有效抑制肿瘤的生长。其机制可能是M CP 和 ES 能配合抑制肿瘤新生血管的形成 ，减少肿瘤的营养供应从而一定水平 抑 制 原 位 肿 瘤 的生长。免疫组化和 EL ISA 结果均显示 在有肿瘤生长和转移的情况下, 血清ga lect in23 和V EGF 的表达均较阴性比照组有明显升高。但M CP 并未降低各组肝转移瘤和血清ga lect in23 的表达, 只能明显抑制肝转移 的形成, 已往 P la t t 等[13] 通过动 物 实 验 也 证 实M CP 能有效抑制肿瘤的生长转移, 但通过W estern B lo t 检测发明M CP 对细胞 ga lect in23 的表达无影响。原因是M CP 只对肿瘤细胞外貌的ga lect in23 有关闭阻断作用, 从而影响其生物学功效表达, 但不影响细胞表达和排泄ga lect in23。同样已往有研究也证实 ES 能 有 效 降 低 肿 瘤 组 织 M VD , 但 并 未 影 响V EGF 的表达[2]; 本实验结果也显示各组肝转移瘤 和血清V EGF 的表达也无明显差别 但M VD 却有下降趋势 标明通过使用ES 能有效抑制血管内皮细胞形成微血管的形成 并一定水平上抑制肿瘤的生长。但由于ES 的作用靶点是血管内皮细胞而非肿瘤细胞, 肿瘤细胞排泄表达V EGF 并不受影响, 这与古板抗癌药物通过直接杀伤肿瘤细胞减少V EGF 表达而引起M VD 降低的机制差别; 并且有看法认为这种抑制新生血管生长会加重瘤体内的相对缺氧, 反而会刺激肿瘤细胞排泄V EGF [15]。
实验中低浓度M CP 组、ES 组、低浓度M CP + ES 组的肿瘤生长和肝转移情况与阳性比照组比较未见明显差别 但随M CP 的浓度增加可见各指标均有下降趋势。而单用M CP 与M CP+ ES 治疗对脾脏种植瘤生长的影响并无显著差别, 均可能与本实验样本量较少、非参数检验要领敏感性较低有关, 需进一步增加样本量进行研究。
本研究结果标明, 单独使用一定浓度的M CP 或M CP 联合ES 能显著抑制结肠癌肝转移的形成和肿
瘤生长, 并能抑制转移瘤中M VD 数目, 提示通过同时阻断肿瘤细胞的聚集黏赞同抑制新生血管形成能有效抑制结肠癌肝转移的形成, 这将为临床上防治结肠癌肝转移提供一个新的偏向。M CP 作为一种来源于天然植物身分、高效低毒的药物, 可望为治疗结直肠癌肝转移和其它恶性肿瘤转移开辟新的偏向,
并可凭据肿瘤表达 ga lect in23 的情况为患者提供个性化的治疗战略。而ES 作为一种靶向药物其效果也日益受到重视。但由于M CP 和ES 对肿瘤细胞均无直接杀氨慎用 两者如何联合化疗药物提高对结肠癌肝转移的疗效仍有待深入研究。
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Inh ibitory effect of modif ied citrus pectin and endosta tin on l iver m eta sta s is from colon cancer
L IU Haiying, HUANG Zh iliang, YANG Guohua
(Departm ent of A bdom inal Surgery, T he A ffiliated Cancer Hosp ital of
Guangzhou M edical Co llege, Guangzhou, 510095, Ch ina)
Abstract: Objective To investigate the inh ibito ry effect of m odified citrus pectin (M CP ) com bined w ith endo statin
(ES) on liver m etastasis from co lon cancer in m ouse. M ethods CT 226 co lon cancer cells w ere injected into the subcap sule of
sp leen in Balböc m ouse to establish a co lon cancer liver m etastasis m odel. O ne hundred and th irty2five m ouse w ere divided into 9 group s random ly: negative contro l group , po sitive contro l group , low M CP group , m edium M CP group and h igh M CP
group , ES group , low M CP + ES group , m edium M CP + ES group and h igh M CP + ES group. T he concentrations of M CP in w ater w ere 0. 0, 0. 0, 0. 01, 0. 025, 0. 05, 0. 0, 0. 01, 0. 025, 0. 05 göL , respectively. T he concentration of ES w as 2 m gökg,
injected into the abdom inal cavity once every 2 days. T he liver m etastasis w as observed after 3 w eek s. T he exp ressions of galectin23, vascular endo thelial grow th facto r (V EGF ) and tum o r m icrovessel density (M VD ) in liver m etastasis w ere
exam ined w ith tissue m icroarray technique and imm unoh istochem istry. T he concentrations of galectin23 and V EGF in serumw ere detected by enzym e linked imm uno so rbent assay (EL ISA ). Results T he percentage of liver m etastasis in each groupw as 100. 0% , 80. 0% , 73. 3% , 60. 0% , 86. 7% , 73. 3% , 73. 3% , 60. 0%. T he num ber of liver m etastases in h igh M CP group ,m edium M CP + ES group and h igh M CP + ES group w as significantly few er than that in po sitive contro l group (P < 0. 05). T he num ber of liver m etastases in h igh M CP + ES group w as significantly few er than that in h igh M CP group (P < 0. 05).
T he m edian vo lum e of sp leen im p lanted tum o r in each group w as 1. 51 cm , 0. 93 cm , 0. 77 cm , 0. 70 cm , 1. 25 cm , 1. 15 cm ,
0. 75 cm and 0. 67 cm . T he size of sp leen im p lanted tum o r in m edium M CP group , h igh M CP group , m edium M CP+ ES group and h igh M CP + ES group w as sm aller com pared w ith po sitive contro l group (P < 0. 05). T he exp ression of galectin23 and
V EGF in liver m etastasis in each group w as no t significantly different (all P > 0. 05). T he concentration of galectin23 and V EGF in serum in po sitive contro l group and all treatm ent group s w as significantly h igher than that of negative group (P <
0101 ). T here w as no significant difference betw een the po sitive contro l group and treatm ent group s (all P > 0. 05). T he M VD counts in liver m etastases w ere 28 47±3 22 27 47±3 22 26 92±1 47 26 91±2 41 26 43±1 47 26 50±3 09
. . , . . , . . , . . , . . , . . , 25145±1. 96 and 24. 73±3. 09, respectively. Com pared w ith po sitive contro l group , the M VD of liver m etastasis focus in ES group , low M CP + ES group , m edium M CP + ES group and h igh M CP + ES group w as significantly low er (P < 0. 05).
Conclusion M CP alone o r com bine w ith ES can inh ibit liver m etastasis from co lon cancer and angiogenesis effectively in m ouse.
Key words: co lonic neop lasm s; liver neop lasm sösecondary; liver neop lasm södrug therapy; pectins; endo statinsö
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